Эмбриологический протокол

Протокол культивирования

Протокол культивирования эмбрионов по дням проводится для того, чтобы выбрать более сильные зародыши.

Развитие зародышей происходит следующим образом:

• 1 день – проводится пункция;
• 2 день – клетки начинают делиться, при нормальном развитии должно быть от 2 до 4 бластомер;
• 3 день – здоровые клетки продолжают делиться, бластомеров уже от 6 до 8;
• 4 день – клетки разделяются на 10-16 бластомеров;
• 5-6 день – бластомеры превращаются в бластоцисты, что увеличивает шансы имплантации.

Самые лучшие среды для культивирования эмбрионов считается та, которая близка к среде жидкости, находящейся в маточных трубах. В каждом отдельном случае проводится индивидуальное культивирование эмбриона в естественном цикле, так как у каждой женщины сроки овуляционного цикла свои.

Расшифровка протокола производится исключительно врачом-эмбриологом на основании формы, цвета, размера бластоцисты. Лаборант ежедневно проводит исследование каждого зародыша и вносит отметку в карту. Такой подход помогает выбрать самый подходящий образец для подсадки в маточные трубы будущей матери.

Категории

При культивации эмбрионов врач производит условную оценку бластоцист. Это помогает выбрать самые качественные клетки для дальнейшей подсадки. Врач оценивает степень зрелости, внутриклеточную массу и толщину наружного слоя. Выставляя оценку из одной цифры и двух букв соответственно.

Рассмотрим, что означают эти цифры и буквы.

1 — не зрелая, полость составляет половину объема;

2 — бластоциста не больше, чем дробящийся эмбрион;

3 — бластоциста намного больше дробящегося эмбриона, полость большая;

4 — полость занимает всю бластоцисту, она начинает пробиваться через оболочку;

5 — бластоцисты продолжает разрывать оболочку;

6 — бластоциста без оболочки.

Первая буква А характеризует содержимое клетки, то есть ту массу, из которой будет в дальнейшем формироваться ребенок:

А — качественная, клеток много;

В — относительно качественная, имеет небольшие отклонения;

С — наблюдаются серьезные нарушения;

D — очень плохое качество бластоцисты.

Вторая буква описывает состояние внутриклеточной оболочки, от которой в последствии будет зависеть процесс прикрепления плода к стенке матки.

А — отличное качество, слой состоит из большого количества клеток;

В — есть небольшие отклонения, например, клеток меньше, либо они располагаются в два слоя;

С — клеток мало, слой плохого качества;

D — очень плохое качество слоя.

Таким образом, можно сделать вывод, что самый качественный эмбрион будет с обозначением 4АА и 5AA. Допустимы к подсадке все бластоцисты, кроме самых плохих и незрелых, который по определению не смогут имплантироваться.

В каких случаях проводится ЭКО?

Экстракорпоральное оплодотворение назначается при диагностировании у одного или обоих родителей бесплодия. Под этим термином подразумевается неспособность семейной пары зачать естественным образом в течении 12 месяцев при ведении активной половой жизни без использования средств контрацепции. Заболевания, провоцирующие бесплодие, можно разделить на несколько категорий:

• Анатомические аномалии — врожденные или приобретенные (вследствие травм, воспалительных заболеваний, хирургического вмешательства) нарушения строения половых органов, такие как непроходимость или отсутствие маточных труб у женщин и семенных канальцев у мужчин, рубцы и спайки в матке;
• Эндокринные (гормональные) патологии — нарушения выработки гормонов, развивающиеся из-за заболеваний яичников у женщин или семенных желез у мужчин, щитовидной железы, надпочечников, а также других органов, не выполняющих секреторную функцию (печени, почек, ЖКТ и т. д.);
• Психические нарушения – сильные эмоциональные переживания, депрессия, шизофрения и другие психопатологии могут вызвать нарушения гормонального фона, провоцировать отторжение эмбрионов;
• Эндометриоз – аномальное разрастание эндометрия (слоя, выстилающего поверхность матки) и связанные с ним спаечные процессы;
• Иммунные аномалии – патологии, вызываемые реакцией женского организма на мужскую сперму, аутоиммунные заболевания мужчины, при котором собственная защитная система стерилизует сперму и т. д.;
• Сексуальные расстройства – патологии, затрудняющие или делающие невозможным естественный половой акт или зачатие, такие как эректильная дисфункция у мужчин, отсутствие или недостаточное качество спермы у мужчин, вагинизм, фригидность у женщин;
• Инфекционные заболевания – вирусы, грибки, бактерии, кишечные паразиты способны нарушить работу половых органов, вызвать общие заболевания (воспалительные, эндокринные и т. д.), затрудняющие зачатие или наступление беременности, спровоцировать слишком резкий иммунный ответ женского организма;
• Генетические нарушения – некоторые хромосомные патологии сопровождаются невозможностью зачать или выносить здорового ребенка, например синдромы Мартина-Белла, Калмана, Нунан, мускрвисцидоз и т. д.;
• Обменные нарушения – такие заболевания, как сахарный диабет, анемия, ожирение и т. д. тесно связаны с гормональными сбоями и потому являются дополнительным фактором, мешающим наступлению беременности.

Помимо этого, в медицинской практике имеются случаи психологического бесплодия. Оно развивается вследствие осознанного или неосознанного нежелания женщины беременеть, вызываемого страхом перед потерей привлекательности, болью, сопровождающей процесс вынашивания и родов и т. д. Психологическая реакция в этом случае способна вызвать физиологические последствия, мешающие зачатию – например, изменение гормонального фона, сбой в обмене веществ и т. д.

На практике бесплодие может быть спровоцировано как одной причиной, так и комплексом указанных факторов. Неспособность к нормальному зачатию выявляется как одного из родителей, так и у обоих сразу. Поэтому для определения точной причины бесплодия каждый из них проходит диагностику.

Еще одной причиной для проведения экстракорпорального оплодотворения, является отсутствие женщины постоянного полового партнера или супруга. Это может обуславливается психологическими, ценностными установки будущей матери, ее социальным положением и другими факторами. При этом физиологически она может быть абсолютно здорова физиологически. Другой, менее распространенной в нашей стране, ситуацией является желание однополой пары завести ребенка. В этом случае генетический материал для получения эмбрионов может быть взят от обоих родителей.

Перенос

Перенос эмбрионов может проводиться не только на 5 сутки на стадии бластоцисты. В некоторых случаях может быть рекомендован более ранний перенос — на 3 сутки.

Культивирования эмбриона до стадии бластоцисты позволяет выбрать максимально качественные клетки, так как многие из них погибают в искусственных условиях. Подсадка качественных эмбрионов увеличивает шанс наступления беременности.

Но если женщина уже несколько раз неудачно прошла ЭКО с пятидневными бластоцистами, ей может быть рекомендован перенос трехдневных эмбрионов. Возможно, что им будет легче развиваться в естественных условиях и они выживут, сформировав здорового ребенка.

Стоит отметить, что классификация эмбрионов при ЭКО не является приговором. Даже если были получены эмбрионы плохого качества, беременность все равно может наступить. Часто врачи встречаются с ситуацией, когда женщина не может забеременеть с первоклассными бластоцистами. Но при переносе эмбрионов 3 класса беременность успешно наступала и рождался здоровый ребенок.

От чего зависит качество эмбрионов

В первую очередь качество эмбрионов зависит от полноценности половых клеток (мужских и женских).

Неблагоприятные факторы, влияющие на способность половых клеток оплодотвориться и давать здоровую беременность:

• Экология.
• Интоксикации – курение, алкоголь, бытовая химия, лекарственные препараты, растворители, бензин.
• Гинекологические заболевания – СПЯ, эндометриоз – гормональнозависимые процессы, оказывающие влияние на качество ооцитов.
• Ослабленный иммунитет.
• Хроническое переутомление.
• Избыточный вес. Происходит нарушение гормонального баланса.
• Ограничение в пище. Вегетарианство, пост создают дефицит аминокислот, витаминов, микроэлементов.
• Радиация – самый неблагоприятный фактор – нарушает физиологичность процессов деления и роста клеток организма, в особенности тех, которые быстро делятся;
• Частая смена климата и часового пояса приводят к хроническому стрессу.
• Гормональная стимуляция овуляции.

Важно! Пациенты должны полностью выполнять рекомендации врача по проведению стимуляции овуляции. Пропущенная инъекция или сделанная не вовремя – снижает вероятность получения ооцитов при пункции, качество яйцеклеток, а следовательно, и зародышей для переноса

Большое количество клеток при пункции фолликулов, в большинстве случаев, говорит об их низком качестве. Крайне редко бывает так, что из 10–15 полученных яйцеклеток оплодотворяются все и получается 10–15 бластоцист отличного или хорошего качества.

Для того чтобы улучшить качество эмбрионов для переноса перед входом в протокол ЭКО необходимо избегать неблагоприятного влияния перечисленных факторов или свести их к минимуму.

Что представляет собой редукция эмбрионов

Современной медициной многоплодная беременность рассматривается как аномалия и осложнение. Даже для здоровой женщины она означает повышенную нагрузку на организм, а при наличии у будущей матери каких-либо заболеваний такое состояние может нести серьезную угрозу здоровью и жизни. Многоплодная беременность может привести к следующим негативным последствиям:

• интенсивной рвоте и обезвоживанию организма;
• анемии и кислородному голоданию эмбрионов;
• повышению артериального давления;
• выкидышу и преждевременным родам;
• предлежанию плаценты и плода;
• преждевременной отслойке плаценты;
• недоношенности одного или нескольких плодов;
• аномалиям развития зародышей;
• трансфузионному синдрому близнецов и т. д.

Многоплодная беременность не обязательно сопровождается такими осложнениями, но их риск в таком состоянии существенно возрастает. Связано это с тем, что эволюционно женская репродуктивная система предназначена для вынашивания 1 ребенка, поэтому наличие сразу 2 и более эмбрионов чревато негативными последствиями. Из-за ограниченности ресурсов материнского организма вероятно неравномерное развитие одного из плодов (вплоть до его абсолютной нежизнеспособности после рождения) или недоразвитие всех эмбрионов до нормального физиологического состояния.

Редукция эмбрионов – процедура искусственного умерщвления и извлечения «лишних» зародышей с целью создания благоприятных условий для развития 1 оставшегося и снижения рисков для будущей матери. Показаниями к ее проведению являются:

• наличие сразу нескольких прижившихся после эко эмбрионов;
• высокий риск выкидышей и преждевременных родов;
• аномалии развития прижившихся эмбрионов;
• высокий риск маточных кровотечений и других осложнений многоплодной беременности.

Дополнительным показанием к проведению этой процедуры является наличие у женщины различных заболеваний – в частности, расстройств сердечно-сосудистой системы, патологий половых органов, эндокринных нарушений. Также существенной причиной к назначению редукции эмбрионов являются имевшиеся ранее неудачные беременности, закончившиеся выкидышем, преждевременными родами или рождением ребенка с аномалиями развития.

Сделайте первый шагзапишитесь на прием к врачу!

Записаться на прием к врачу

Болезнь недоразвития (Runt disease)

Этот экспериментальный синдром был создан введением незрелому плоду или новорожденному иммунокомпетентных аллогенных клеток взрослого донора, отличных от донора антигенами главного комплекса тканевой совместимости. Введенные реципиенту клетки вызывают внутриутробную смерть и изгнание плода. При этом у новорожденного обнаруживают целый комплекс изменений, как то: недоразвитие, понос, повреждения кожи и шерсти, первоначальная гипертрофия, а затем полная инволюция лимфоидной системы, очаги некроза в печени, селезенке, вилочковой железе. Введение лимфоцитов отцовской линии взрослым гибридным мышам первого поколения вызывает развитие иммунодефицита. Болезнь недоразвития со своими различными вариантами является характерным примером реакции трансплантата против хозяина, когда способные на иммунную реакцию клетки вводятся в чужой организм, неспособный защититься от такой агрессии.

В рамках недавно проведенных исследований удалось вызвать развитие такого синдрома у 57% детенышей самок крыс, сенсибилизированных до беременности к отцовским тканевым антигенам. Сенсибилизацию проводили либо введением лимфоидных клеток после применения циклофосфамида, либо кожным трансплантатом, причем в обоих видах эксперимента ткань для трансплантата брали у животных той линии, с которой в дальнейшем проводилась случка, и которые отличались от матери по антигенам главного комплекса гистосовместимости. Наиболее тяжелые для крысят последствия наблюдались тогда, когда иммунизация матери проводилась за неделю до случки, с таким расчетом, чтобы максимальная сенсибилизация совпала как можно точнее с имплантацией бластоцист. Трансплантаты аллогенных лимфоидных клеток сильнее индуцировали гуморальный иммунитет, чем пересаженная кожа. При этом коэффициент частоты болезни недоразвитости находился в зависимости от численности пересаженных иммунокомпетентных клеток.

В нормальных условиях болезнь недоразвитости не развивается, вероятно, по причине способности плода к сроку родов разрушать, не сенсибилизируясь, небольшое количество лимфоцитов матери, проникающих через плацентарный барьер. Об этом говорит и тот факт, что у страдающих лейкозом беременных, новорожденные лейкозом не страдают, несмотря на то, что меченые лейкоциты матери обнаруживаются в плаценте и в крови пуповины. Плод разрушает лимфоциты матери. Тем не менее, согласно результатам недавно проведенных исследований, в отдельных случаях нельзя исключить развитие болезни у детей. Так, были отмечены случаи развития болезни недоразвитости при попытке лечения иммунодефицитов у грудных детей с дисплазией вилочковой железы и другими нарушениями, которым проводились пересадка костного мозга, трансфузия лейкоцитарной массы, а также переливание эритроцитарной массы без удаления из нее лейкоцитов в тяжелых случаях резус-сенсибилизации. Однако часто на данную патологию без достаточных оснований и «списывали» необъяснимые случаи летальных исходов у грудных детей, страдающих лимфоцитарным химеризмом, поражениями кожи и лимфоидных органов, а также некоторые случаи выкидышей, антенатальной смерти плода и гипотрофии плода.

В заключение нужно сказать, что роль иммунных механизмов в патогенезе отдельных осложнений беременности пока недостаточно выяснена. И если при некоторых патологических состояниях, таких как изоиммунизация матери к эритроцитарным антигенам, в частности к агглютининогену D, участие иммунных механизмов точно установлено, то этого нельзя сказать о выкидыше и позднем токсикозе, где можно говорить в основном о гипотезах. Уточнение роли нарушений иммунных взаимоотношений матери и плода в патогенезе тех или иных осложнений беременности станет возможным только после подробного выяснения механизмов, защищающих фето-плацентарный трансплантат.

Теги:
иммунология репродукции

Классификация эмбрионов на стадии бластоцисты.D.Gardner, et al., 1999.

Степень зрелости бластоцисты:

• 1 степень — ранняя бластоциста, полость бластоцисты меньше половины объема эмбриона.
• 2 степень — полость бластоцисты больше половины объема эмбриона.
• 3 степень — полная бластоциста. Полость полностью занимает объем эмбриона.
• 4 степень — расширенная бластоциста. Полость бластоцисты становится больше и начинает истончаться ZP.
• 5 степень — трофэктодерма ничинает проникать через ZP.
• 6 степень — вылупившаяся бластоциста, покинувшая ZP.

Внутриклеточная масса (ВКМ):

• А — плотно упакованная с большим количеством клеток.
• В — более свободная группировка среднего количества клеток.
• С — незначительное количество клеток

«Растут с колоссальной скоростью»: что такое клеточные культуры и клеточные линии

Культивирование клеток в контейнерах. Фото с сайта biomedstem.ru

В связи с разработкой вакцин звучат термины «клеточная культура» и «клеточная линия».

«Клеточная культура» — это клетки одной ткани (например, кожи или ткани почек) человека или животного, которую выращивают в лабораториях в контролируемых условиях. А «клеточная линия» — это источник культуры клеток. Как правило, линия имеет название в виде аббревиатуры букв латинского алфавита и цифр – по ним можно установить, когда и откуда были взяты клетки. 

Линий (человеческих и животных) десятки, они имеют определенные международные обозначения и хранятся в специальных банках клеток. Такой банк есть и в России – это так называемая Всесоюзная коллекция клеточных культур, образцы которой рассредоточены по различным научным институтам.

Клеточных линий, полученных в результате абортов, или так называемых эмбриональных линий, в мире гораздо меньше.

В основном известны НЕК-293 (получена из почек эмбриона, абортированного в 1972 году), PER.C6 (получена в 1985 году из клеток сетчатки глаза 18-недельного эмбриона), WI-38 (получена в 1964 году из диплоидных клеток легочной соединительной ткани абортированной девочки, которой было около 12 недель), MRC-5 (получена в 1966 году из легочных клеток 14-недельного мальчика), RA27/3 (получена в США в 1964 году от плода, инфицированного краснухой) и ряд других.

При этом у каждой из этих линий своя «специализация» и свои уникальные свойства. Так, на линии RA27/3 до сих пор выращивают вакцину от краснухи, НЕК-293 печально известна благодаря тому, что компания Senomyx использовала ее для тестирования пищевых добавок.

Линия PER.C6 принадлежит компании Johnson & Johnson и ее исключительное свойство в том, что клетки линии растут с колоссальной скоростью: в одном миллилитре суспензии может содержаться до ста миллионов клеток. Есть и линии-«универсалы», например на MRC-5разрабатывается около 10 вакцин от различных заболеваний.

Эмбриональные линии в пищевой отрасли: как это?

Использование клеток эмбриональных линий в пищевой промышленности имеет свою историю. В 1999 году американским биохимиком Либертом Стриером из Стенфордского университета была основана компания Senomyx. Своей целью она ставила исследования в области пищевых добавок, усиливающих вкус и запах пищи.
Уникальные вещества, которые разрабатывали химики в Senomyx, могли не только сделать исходный продукт слаще или солонее, но и, например, заблокировать горечь. Тестировали пищевые добавки на эмбриональной клеточной линии HEK293 – это было дешевле, чем давать образцы добровольцам или ставить сложные эксперименты на животных, не способных сообщить о своих ощущениях.
Альтернативой абортивным материалам могли бы служить специальные клеточные линии, культивируемые из клеток-рецепторов ротовой полости, но эта технология была сложнее, и в итоге было принято решение идти по простому и, главное, дешевому пути. При этом клетки линии HEK293 использовались только на этапе тестирования, в конечный продукт они не попадали. Всего на счету Senomyx 113 патентов, несколько сот различных вкусовых добавок, а также сотрудничество как минимум с семью крупнейшими мировыми компаниями, такими как Heinz, Nestle, Pepsi и другими.
В 2010 году, благодаря американской пролайф-организации «Божьи дети» информация о том, что вкусовые добавки, которые входят в состав кетчупов, чипсов, кубиков и супов быстрого приготовления, сливок, шоколада, газированных напитков, выпускаются по неэтичной технологии, стала широко известна. С полным списком продуктов можно ознакомиться здесь.
В результате большинство партнеров Senomyx открестились от сотрудничества с компанией, объявив о том, что обновляют свои продукты. Сайт Senomyx не обновлялся с 2012 года. Каким образом сегодня обстоят дела с тестированием вкусовых добавок в США и в мире, достоверно не известно.

Клетки растут в биореакторах объемом несколько тысяч литров

Культивирование клеток в биореакторе. Фото с сайта process-worldwide.com

В медицине и фармакологии эмбриональные клеточные линии в настоящее время используются при создании вакцин (векторных или живых) от кори, краснухи, паротита, гепатита А, бешенства, ветряной оспы, коронавируса. Человеческие клеточные линии нужны для размножения вируса, который потом используют в прививке. Ведь вирусам, в отличие бактерий, нужен «хозяин», и этим «хозяином» становятся клетки клеточной линии.

Их также используют для создания лекарственных препаратов от ревматоидного артрита, гемофилии и муковисцидоза. Кроме того, линию НЕК-293 применяют в исследованиях, посвященных поиску раковых терапий. На ней же выращивают адено-ассоциированный вирус, который служит вектором для доставки генов в препарате «Золгенсма», который применяют при терапии спинально-мышечной атрофии. 

Эмбриональные клетки действительно могут делиться практически бесконечно в условиях, созданных для этого в лабораториях. Сторонники этого метода в качестве аргумента, оправдывающего использование абортивного материала, говорят: клеточные культуры, которые используются сегодня, получились в результате длительного деления и уже фактически не являются частью организма некогда абортированного ребенка.

Получение клеточной линии выглядит следующим образом. Ткань или орган, из клеток которых предстоит в будущем развивать клеточную линию, забирают с соблюдением условий асептики, помещают в стерильный солевой раствор и транспортируют в специализированную лабораторию.

В лаборатории ткани и органы тщательно изучают, в том числе на предмет возможного инфицирования. Если установлено, что они «чистые», скальпелем или ножницами измельчают до кусочков размерами не более 1-3 мм, тщательно отмывают от клеток крови в нескольких сменах стерильных растворов, а затем помещают в растворы специальных ферментов, позволяющих изолировать отдельные клетки.

Собственно, эти самые клетки, которые удается выделить с помощью измельчения (иногда для этого даже может понадобиться своеобразное «сито»,  через которое фильтруют полученный из тканей или органов раствор) – это и есть первичная клеточная культура. Ее можно начинать «растить» с помощью питательной среды и ряда специальных технологий.

Большинство клеточных культур растут в так называемом монослое – то есть на дне пластикового или стеклянного контейнера, располагаясь слоем толщиной в одну клетку. Чтобы они размножались быстрее и эффективнее, были придуманы специальные многоэтажные контейнеры.  (Вот так например это выглядит. )

Некоторым типам клеток требуется постоянное перемешивание  – для них были изобретены «шейкеры», которые встряхивают сосуды с клетками. Например, в Италии для создания вакцин в заводских условиях используют одновременно 28 тысяч особых роллерных флаконов. Автоматика при этом контролирует температуру и скорость вращения. А когда на заводе заменили гладкие стеклянные флаконы на гофрированные из пластика, увеличив площадь поверхности, получили двадцатикратный прирост клеток, а удвоение клеточной популяции происходит всего за 8 с небольшим часов.

Но лучше всего работает технология, при которой клетки размножаются в виде суспензии в специальном биореакторе. Такие реакторы объемом до 8 тысяч литров работают в странах Европы и в США.

При этом, собственно клетки эмбриональной линии в конечный продукт (прививку) попадать не должны.

Когда вирус размножится в достаточном количестве, его разными средствами отделяют от клеточной культуры, очищают от примесей. Для этого могут использовать разные методы – электрофорез, различные химические вещества, окрашивание и даже многоуровневая фильтрация. Полученный же чистый вирус или его фрагменты добавляют в вакцину вместе с другими веществами, которые обеспечат ее консервацию, стабильность и в дальнейшем – необходимое воздействие на организм.